Da Francis I på ny invaderede Italien med en fransk hær i 1524, skiftede pave Clement VII side og støttede franskmændene. Dette var en fejltagelse. Det afgørende franske nederlag ved Pavia året efter overlod Italien til den sejrrige spanske konge og tysk-romerske kejser Karl Vs nåde. Den hastigt dannede anti-habsburgske Cognac-liga – paven, Francis, Francesco Sforza af Milano, og herskerne af Venedig og Firenze – viste sig at være hjælpeløs over for den spanske hær, som nu var den bedste i Europa. Kommanderet af den frafaldne franske hertug Charles af Bourbon strømmede spanierne ned gennem halvøen og angreb Rom. Selvom hertugen faldt under angrebet, stormede hans hær ind i byen den 6. maj 1527. De sejrrige spaniere og deres tyske allierede lejetropper, som udgjorde 30.000 mand, plyndrede derpå byen på en måde som mindede om barbarernes hærgen 1.100 år tidligere. Tusinder af romere blev massakreret. Paven blev taget til fange. Efter hans løsladelse flygtede Clement til Orvieto, men han vendte tilbage året efter for at acceptere en fredsaftale med Charles, som genoprettede Pavestaten. I 1530 kronede han Karl som konge af Lombardiet. Imens skiftede skuepladsen for de Valois-Habsburgske krige til det vestlige Europa.