I foråret 1564 etablerede franske huguenotter anført af René
de Laudonnière Fort Caroline ved Saint Johns-flodens munding, i
det nuværende Florida. Garnisonen blev forstærket af Jan Ribault året efter. For at imødegå denne trussel mod spanske
besiddelser i Amerika, afsendte Filip
II en ekspedition under Pedro
Menéndez de Avilás. Menéndez gik i land den 7.
og 8. september 1565 og grundlagde Saint Augustine syd for den franske
bosættelse. Ni dage senere begyndte spanierne en march over land
til Fort Caroline. Den 20. september stormede de fortet, og dræbte
132 af forsvarerne i løbet af angrebets første time. Laudonnière
var en af de få overlevende efter angrebet. Ribault blev taget til
fange og dræbt måneden efter. Fort Caroline blev omdøbt
til San Mateo.
Franskmændene gjorde gengæld den 6. april
1568. En ekspedition på tre skibe under Dominique de Gourgues erobrede
San Mateo og hængte de overlevende fra den spanske garnison.